Expression des ARN viraux et cellulaires

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Projets

WP1-Structure/fonction des IRES viraux et cellulaires

(a) L’IRES du VIH-1

L’ARN génomique du VIH-1 contient plusieurs séquences IRES dont une qui nous intéresse particulièrement et qui est localisée dans la région codant pour Gag. L’expression de cette IRES permet la synthèse d’une protéine Gag tronquée de 40 kDa qui est bien produite in vitro mais plus difficile à mettre en évidence dans les cellules. Notre recherche s’oriente à la fois sur les mécanismes de synthèse de cette protéine et son rôle au cours du cycle viral.

(b) Importance du mécanisme IRES in vivo

Les IRES (Internal Ribosomes Entry Segments) ont été mis en évidence il y a maintenant 30 ans et ils permettent l’expression de protéines cellulaires ou virales dans des conditions de stress ou lorsque l’équilibre homéostatique de la cellule est perturbé. Cependant, ce postulat repose principalement sur des études qui ont utilisé des systèmes de gènes rapporteurs traduits in vitro ou transfectés dans les cellules. Nous souhaitons mesurer l’importance du mécanisme IRES à partir de gènes endogènes (IRES cellulaires) et viraux (provirus intégré) au sein de la cellule. Pour se faire, nous utilisons la technologie des Nanoblades pour éditer les régions d’ARN responsables de l’activité IRES et mesurer, ainsi, les conséquences sur l’expression génique et la survie de la cellule.

 

WP2-Le rôle des éléments traces dans la traduction, le métabolisme de l’ARN et la réplication virale

(a) Le Sélénium

Le sélénium est un oligo-élément essentiel impliqué dans de nombreux aspects de la santé humaine mais aussi certaines maladies. Dans l’organisme, le sélénium est incorporé au sein d’un acide aminé rare, la sélénocystéine (Sec), qui permet la synthèse des sélénoprotéines. Celles-ci sont impliquées dans les défenses antioxydantes, l’homéostasie redox, la signalisation redox et très certainement d’autres processus cellulaires. Au niveau épidémiologique, il existe une corrélation entre une carence en sélénium et la progression du HIV-1. Au niveau moléculaire et cellulaire, nous avons obtenu des données préliminaires qui indiquent une influence du niveau de sélénium dans le milieu de culture sur l’expression des protéines virales HIV gag suite à l’infection de cellules Jurkat. Nous cherchons donc maintenant à comprendre la relation qu’il existe entre l’expression des sélénoprotéines et le processus de réplication viral.

 

(b) le Zinc

Le zinc naturel se présente sous la forme d’un mélange de 5 isotopes stables avec les abondances relatives suivantes: 64Zn (48.268 %), 66Zn (27.975 %), 67Zn (4.102 %), 68Zn (19,024 %) et 70Zn (0.631 %). Une modification des rapports d’abondances naturelles des isotopes du zinc (dit fractionnement isotopique) a déjà été observé dans plusieurs conditions physiologiques et pathologiques et la composition isotopique du zinc varie d’un organe à l’autre chez les mammifères.

La protéine NCp7 du VIH-1 est essentielle à la réplication virale et intervient au cours de nombreuses étapes du cycle. Cette protéine a des propriétés chaperones d’acides nucléiques qui lui sont conférées par la présence de deux motifs à doigts de zinc. De fait, il est possible que le recrutement spécifique d’un des isotopes modifie les propriétés biochimiques de la NCp7 et pourrait aussi avoir des effets sur la réplication virale. C’est l’objectif de ce projet que nous menons en collaboration avec le Dr. Vincent Balter (ENS de Lyon) qui est un spécialiste du fractionnement isotopique.

 

WP3-Développements biotechnologiques

Nous avons généré un système de traduction in vitro qui utilise des ribosomes isolés à partir de cellules, tissus ou organes. Cela permet d’étudier l’expression d’ARN synthétiques avec un appareil traductionnel qui peut être mofifié ou spécialisé selon les cellules à partir duquel il est issu. Cet outil a notamment été utilisé, en collaboration avec le Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon, pour montrer que les ribosomes de cellules cancéreuses influencaient fortement l’expression de l’ARN cible.

Nous avons également récemment breveté et publié un moyen de transfection (Nanoblades) basé sur une particule virale modifiée qui contient tous les éléments protéiques et nucléiques nécessaires du système CRISPR/Cas9 pour l’édition de gènes dans les cellules.

 

WP4-Epissage de l’ARN et modifications m6A dans les cellules infectées par le virus EBV

Le virus d’Epstein-Barr (EBV) est un herpesvirus humain ubiquitaire associé à de nombreux cancers chez des individus immunocompétents, ainsi qu’à des lymphoproliférations et lymphomes chez des individus immunodéprimés. Une étude transcriptomique réalisée à partir d’ARN provenant de cellules B primaires infectées par EBV et prélevés à différents temps post-infection montre que l’infection par EBV modifie profondément le profil d’expression des gènes cellulaires. Ces changements transcriptionnels rapides et importants se produisent pour l’essentiel dans les 24 heures post-infection et précèdent les changements métaboliques et phénotypiques.

(a) A partir de ces données, nous nous intéresserons particulièrement aux modifications du profil d’épissage de certains ARNm cellulaires suite à l’expression précoce des protéines virales. En effet, EBNA2 et EBNA-LP dont dépendent les premières étapes d’activation et de prolifération des cellules après infection par EBV, sont responsables de la génération d’isoformes particulières de certains ARNm. Nous souhaitons caractériser ces isoformes et déterminer leur rôle dans la transformation des cellules infectées.

(b) Nous étudierons également les modifications de l’épitranscriptome, notamment au niveau des profils de méthylation des adénosines. En effet, l’étude transcriptomique décrite ci-dessus montre que l’expression des gènes dont les produits sont impliqués dans les modification m6A des ARN (notamment les gènes codant pour les protéines ‘eraser’ ‘writer’ et ‘reader’) est modifiée. Nos objectifs sont donc de définir si EBV est capable de modifier l’épitranscriptome des ARNm cellulaires et déterminer par quels mécanismes, c’est-à-dire identifier les protéines ou les miRNA du virus qui assurent la médiation de la reprogrammation de l’épitranscriptome cellulaire.